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Apr 23, 2023

Comprensione della tecnologia dell'ibridoma per la produzione di anticorpi monoclonali

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La tecnologia dell’ibridoma prevede la fusione di cellule B produttrici di anticorpi di breve durata con cellule immortali di mieloma. Le linee cellulari risultanti producono una fornitura infinita di uno specifico anticorpo monoclonale.1 La tecnica è stata creata nel 1975 dagli scienziati vincitori del premio Nobel Georges Kohler e Cesar Milstein.

Anticorpi monoclonali

Gli scienziati creano anticorpi monoclonali clonando una singola linea cellulare che produce anticorpi. A differenza degli anticorpi policlonali, i monoclonali sono altamente specifici per un antigene. Unendo le cellule del mieloma che possono dividersi indefinitamente con le cellule B che producono anticorpi specifici contro il bersaglio di interesse, i ricercatori ottengono una fonte quasi illimitata di anticorpi monoclonali identici.2

Dal 1986, oltre 117 anticorpi monoclonali sono stati approvati dalla FDA, a cominciare dall'anticorpo monoclonale murino Muromonab-CD3 per il rigetto del trapianto di rene.3 Oltre agli anticorpi provenienti da topi e umani, i ricercatori hanno prodotto anticorpi monoclonali chimerici e umanizzati composti da sequenze da entrambe le specie. Sostituendo le sequenze proteiche derivate dai topi con quelle umane, questi anticorpi monoclonali riducono il rischio di innescare una risposta immunitaria negli esseri umani.4 Utilizzando vari metodi, gli scienziati hanno anche prodotto anticorpi monoclonali da altri mammiferi per diversi scopi.

Fase 1: immunizzazione

I ricercatori iniettano in un mammifero, tipicamente un topo, un antigene bersaglio, stimolando una risposta immunitaria. L’iniezione dell’antigene può avvenire in serie nel corso di diverse settimane. Quindi, i ricercatori raccolgono la milza del topo per ottenere cellule B che producono l'anticorpo desiderato.1

Passaggio 2: fusione cellulare

I ricercatori fondono le cellule B produttrici di anticorpi con le cellule del mieloma in colture cellulari. Il glicole polietilenico (PEG) facilita la fusione delle membrane plasmatiche di entrambe le cellule, formando una singola cellula ibridoma con due o più nuclei. In alternativa, l'elettrofusione può unire le cellule utilizzando un campo elettrico pulsato.5

Passaggio 3: crescita delle cellule di ibridoma

Meno dell'1% delle cellule iniziali si fonde per formare cellule di ibridoma. Le cellule B non utilizzate nella coltura smettono di dividersi naturalmente, mentre la chemioterapia distrugge le cellule del mieloma non fuse. I ricercatori utilizzano il terreno HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina) per consentire la proliferazione selettiva di linee cellulari produttrici di anticorpi monoclonali immortali. L'amminopterina nel mezzo HAT arresta la sintesi dei nucleotidi, mentre l'ipoxantina e la timidina possono essere utilizzate dalle cellule, come le cellule B, che trasportano l'enzima HGPRT (ipoxantina-guanina fosforibosil transferasi). Le cellule di ibridoma con l'enzima HGPRT funzionale possono sopravvivere e crescere, mentre le cellule di mieloma che ne sono prive alla fine muoiono.1

Passaggio 4: screening

I ricercatori spesso selezionano le cellule di ibridoma per l'anticorpo monoclonale di interesse utilizzando un test immunoassorbente legato a un enzima (ELISA). Gli ELISA indiretti identificano gli anticorpi con la specificità appropriata immobilizzando l'antigene su una superficie e incubandolo con un surnatante di cellule di ibridoma. I ricercatori utilizzano anche tecniche tra cui western blot, citometria a flusso e spettrometria di massa con immunoprecipitazione per analizzare le loro colture di ibridomi.1

Passaggio 5: espansione dell'ibridoma

La fase finale prevede la clonazione delle cellule di ibridoma desiderate per ottenere una popolazione cellulare stabile e la crescita della coltura per raccogliere grandi quantità di anticorpi monoclonali. Ciò può essere ottenuto attraverso uno dei due metodi.1

Questa tecnologia offre numerosi vantaggi, in particolare1,6

Tuttavia, la tecnologia presenta anche alcune limitazioni.1,7

Applicazioni diagnostiche

Grazie alla loro elevata specificità, gli anticorpi prodotti dalla tecnologia dell'ibridoma hanno un'ampia gamma di applicazioni diagnostiche, tra cui le seguenti.

Immunoterapia

Esistono varie indicazioni approvate dalla FDA per gli anticorpi monoclonali (vedere la tabella seguente).3 Le indicazioni comuni includono le seguenti.

Anticorpo monoclonale