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Sintesi vs. recupero dell'estere

Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 306 (2023) Citare questo articolo

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Il Toxoplasma gondii è un patogeno zoonotico diffuso che infetta il bestiame e l'uomo. L’eccezionale capacità di questo parassita di riprodursi in diversi tipi di cellule ospiti nucleate richiede un utilizzo coordinato di risorse nutrizionali endogene e derivate dall’ospite per la biogenesi della membrana. La fosfatidiletanolamina è il secondo glicerofosfolipide più comune nel T. gondii, ma rimane enigmatico il modo in cui il suo fabbisogno nello stadio di tachizoite a divisione rapida, acutamente infettivo, viene soddisfatto. Questo lavoro rivela che il parassita utilizza sintesi de novo e percorsi di salvataggio per soddisfare la sua richiesta di PtdEtn legato a esteri ed etere. La deplezione mediata da auxina della fosfoetanolammina citidililtransferasi (ECT) ha causato un fenotipo letale nei tachizoiti a causa della compromissione dell'invasione e della divisione cellulare, rivelando un ruolo vitale della via CDP-etanolamina durante il ciclo litico. Di conseguenza, il complesso della membrana interna appariva interrotto in concomitanza con una diminuzione della sua lunghezza, larghezza del parassita e dei principali fosfolipidi. La lipidomica integrata e le analisi isotopiche del mutante TgECT hanno svelato la sintesi endogena dell'estere-PtdEtn e il recupero dei lipidi legati all'etere dalle cellule ospiti. In breve, questo studio dimostra come T. gondii utilizzi vari mezzi per produrre forme distinte di PtdEtn pur presentando la rilevanza terapeutica della sua sintesi de novo.

Il phylum protozoico Apicomplexa comprende molti patogeni intracellulari comuni, come Toxoplasma, Plasmodium, Eimeria e Cryptosporidium. Il Toxoplasma gondii, l'unica specie conosciuta del genere, ha una notevole capacità di infettare molti tipi di cellule nucleate in vari vertebrati; è quindi riconosciuto come uno degli agenti patogeni di maggior successo. L'infezione naturale degli ospiti da parte di T. gondii inizia con l'ingestione delle oocisti o cisti presenti nell'alimento contaminato. Gli stadi sporozoite e bradizoite rilasciati rispettivamente dall'oocisti o dalla cisti, infettano l'epitelio gastrico e si sviluppano ulteriormente in uno stadio tachizoite altamente infettivo, promiscuo e a rapida divisione, che si riproduce in altri tessuti, causando infine necrosi mediante cicli litici perpetui1,2. In seguito a stress fisico-chimico e immunitario, alcuni tachizoiti si differenziano in bradizoiti incistati, stabilendo un'infezione cronica. Per la riproduzione intracellulare all'interno delle cellule ospiti, il parassita deve produrre sufficiente biomassa di membrana attraverso le sue vie di sintesi e salvataggio, molte delle quali conferiscono eccellenti bersagli terapeutici antiparassitari3,4.

I glicerofosfolipidi costituiscono un ingrediente importante delle biomembrane nei tachizoiti di T. gondii4,5,6,7,8. Fosfatidilcolina (PtdCho), fosfatidiletanolammina (PtdEtn), fosfatidiltreonina (PtdThr), fosfatidilserina (PtdSer), fosfatidilinositolo (PtdIns), fosfatidilglicerolo (PtdGro) e fosfatidato (PtdOH) sono tipici fosfolipidi presenti in tachizoiti e necessari per il ciclo litico ottimale5,7, 9,10,11,12. Oltre al loro ruolo consueto nella replicazione dei parassiti, molti fosfolipidi sono recentemente emersi come attori chiave nell'omeostasi del calcio e nella trasduzione del segnale, contribuendo alla motilità di scorrimento, all'invasione e all'uscita dei tachizoiti7,12,13,14,15. Il parassita è in grado di sintetizzare i fosfolipidi utilizzando precursori acquisiti dalla cellula ospite5,7,9,10,11,12,16,17,18,19. Inoltre, può salvare alcune specie/sonde di fosfolipidi dall'ambiente extracellulare e/o intracellulare12,18,20.

PtdEtn è il secondo fosfolipide più comune nei tachizoiti, presente in forme estere ed etere5,6,7. Diverse vie possono produrre estere-PtdEtn, comprese le distinte decarbossilasi PtdSer (PSD) situate nel mitocondrio parassita e nel vacuolo parassitoforo, la CDP-etanolamina, ovvero la via Kennedy nel reticolo endoplasmatico e tramite il ribaltamento mediato da P4-ATPasi nella membrana plasmatica5,10, 20,21. La sua sintesi endogena attraverso la via CDP-etanolamina richiede uno scaffold di diacilglicerolo che può essere generato dai tachizoiti18. Sebbene non sia stato ancora studiato in T. gondii, il PtdEtn legato all'etere contiene uno scheletro di alchil-glicerolo costituito da un'alchil-glicerone fosfato sintasi nelle cellule di mammifero22. In termini funzionali, la forma conica dell'estere-PtdEtn contribuisce alla curvatura della membrana, regolando gli eventi di gemmazione, fusione e fissione e facilitando così le interazioni membrana-proteina23. D'altra parte, la forma dell'etere-PtdEtn consente un legame idrogeno intermolecolare più forte tra le teste, con conseguente diminuzione della fluidità della membrana22,24.

100 residues compared to canonical homologs. TgECT is exceptional with a long extension of about 500 amino acids, resulting in a 3× larger protein than its non-apicomplexan counterparts (Fig. 1a)./p>16 parasites were barely present under ECT-depleted conditions, contrasting with the control cultures. In agreement, the assessment of endodyogeny demonstrated a strongly impaired daughter cell formation only in the IAA-treated TgECT-AID-3xHA mutant (Fig. 3b)./p>200 parasitophorous vacuoles. e Invasion efficiency of the indicated strains (−/+IAA). A total of >1000 events were scored for the shown bar graphs. f Gliding motility of tachyzoites. TgSAG1-stained parasites were analyzed for the motile fraction (200–400 cells, n = 4 assays) and trail length (>60 trails per group, except for IAA-treated TgECT-AID-3xHA (13 trails)). g The yield of tachyzoites (−/+IAA). HFF monolayers (106 cells) were infected with indicated strains (MoI = 1) and cultured for 48 h with or without IAA, followed by parasite counting. The (a–g) show data from n = 3 or more experiments (means ± S.E.; *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001)./p>5-fold), C34:2 (∼11x), C36:2 (∼10x), C38:4 (∼6x) and C40:5 (∼6x) (Fig. 7c), which confirmed the presence of a functional CDP-ethanolamine pathway5,10. The IAA-mediated ECT depletion impaired the isotope labeling of C34:1, C34:2, and C36:2 species, consistent with the observed decline in their content (Fig. 7a). By contrast, the 13C2-labeling of C38:4 and C40:5 PtdEtn were not affected by IAA (Fig. 7c) in accord with their unperturbed or increased levels (Fig. 7a). Tachyzoites grown in 13C2-ethanolamine-labeled host cells did not show isotopic enrichment in any of the ester-PtdEtn species ruling out salvage of these lipids (Fig. 7c). Inversely, we witnessed an opposite phenomenon for ester-PtdEtn species (A34:2, A36:5) that were 13C2-enriched (∼4–5x) in intracellularly-grown but not in host-free parasites (Fig. 7d). Other lipid species (A38:5, A38:6, A40:6) were labeled equally under both settings (∼2–3x), and as expected, no change in 13C2-labeling of ether-PtdEtn was seen upon depletion of ECT. The data entail that ester-PtdEtn species are synthesized primarily de novo using the CDP-ethanolamine pathway, while the parasite salvages ether-linked PtdEtn species from its host cell./p>600 amu; MS2 range 50-1050 amu) with an accumulation time of 150 ms, collision energy of 35 V and a CE spread of 15 V. Data processing was done using the Analytics module of SciexOS and MSDial42./p>